隨著寡核苷酸黃金時(shí)代的來(lái)臨，為寡核苷酸合成造就越來(lái)越豐富的應(yīng)用場(chǎng)景。合成是為了獲得盡可能多的、完美匹配下游應(yīng)用的終產(chǎn)量，同時(shí)需要保證產(chǎn)物的質(zhì)量，還要考慮如何能夠有效維系合成過(guò)程的高偶聯(lián)效率，以及成本的節(jié)約等等。那么，什么是合成終產(chǎn)量？合成終產(chǎn)量的影響因素有哪些？各個(gè)因素又是如何影響著合成終產(chǎn)量的？怎樣改進(jìn)各因素對(duì)合成終產(chǎn)量的不利影響？成本的節(jié)約只是單純地對(duì)標(biāo)極短的合成時(shí)間嗎？本期文章將通過(guò)以下三個(gè)方面來(lái)為您一一解答。

1. 合成終產(chǎn)量的理論值計(jì)算方法

2. 影響合成終產(chǎn)量的因素

3. 提升合成終產(chǎn)量的方法

一、合成終產(chǎn)量的理論值計(jì)算方法 

寡核苷酸合成終產(chǎn)量的理論值可根據(jù)以下公式計(jì)算：

例如，合成平均偶聯(lián)效率為99%的30 mer寡核苷酸（29個(gè)偶聯(lián)步驟），理論上可得75%產(chǎn)量（0.9929）。然而，若以98%的效率進(jìn)行相同的合成，最大合成終產(chǎn)量?jī)H為56%。而在實(shí)踐中，即使偶聯(lián)效率為99%，所能期望的最高合成終產(chǎn)量也僅為50%。在偶聯(lián)效率為98%時(shí)，合成終產(chǎn)量甚至低達(dá)25%。

二、影響合成終產(chǎn)量的因素

1. 偶聯(lián)效率（coupling efficiency）

合成的偶聯(lián)效率對(duì)終產(chǎn)量非常重要，決定了寡核苷酸可以合成長(zhǎng)度以及最終產(chǎn)品的質(zhì)量。偶聯(lián)效率下降僅幾個(gè)百分點(diǎn)就會(huì)大大降低實(shí)際產(chǎn)量，而且會(huì)影響下游純化。

在每個(gè)合成周期中（each cycle of synthesis），化學(xué)或物理因素的限制使得偶聯(lián)效率無(wú)法達(dá)到100%，因?yàn)榧幢闶褂镁?xì)的化學(xué)合成試劑，總會(huì)有一些 support-bound 寡核苷酸不會(huì)偶聯(lián)。由此，每個(gè)合成周期都會(huì)產(chǎn)生小于百分比 n-1 產(chǎn)物（<1%），并會(huì)逐步積累。隨著序列長(zhǎng)度的增加，n-1 產(chǎn)物的總百分比也會(huì)增加。99.4%偶聯(lián)效率的20 mer寡核苷酸預(yù)估產(chǎn)量為89.2% FLP（full-length product），而具有相同偶聯(lián)效率的50 mer寡核苷酸預(yù)估產(chǎn)量為74.5% FLP。寡核苷酸長(zhǎng)度、偶聯(lián)效率和FLP百分比之間的關(guān)系參看下圖。

如圖所示，合成的偶聯(lián)效率決定著合成產(chǎn)量及合成長(zhǎng)度。

平均偶聯(lián)效率（average coupling efficiency）所對(duì)應(yīng)的終產(chǎn)量可參看下表數(shù)據(jù)。

2. 合成儀

合成儀的良好性能有助于高效的合成實(shí)驗(yàn)，雖然事實(shí)上，維持每臺(tái)合成儀每天的合成效率達(dá)到99%或更高是很難的，但是優(yōu)質(zhì)的合成儀可以作為提升并保持高效合成效率的前提和保障。那么，合成儀值得關(guān)注的性能參數(shù)主要指那些？

（1）在合成較長(zhǎng)鏈且可獲得一定的產(chǎn)物得率的背景下，合成效率可達(dá)99%以上。

單一合成效率的數(shù)據(jù)缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性與可信度，具備合成長(zhǎng)度及規(guī)模的前提是必要的，這樣的合成效率數(shù)據(jù)才能使用戶了解到更加真實(shí)準(zhǔn)確的合成效率，為實(shí)際應(yīng)用做好準(zhǔn)備。

（2）在保證終產(chǎn)物質(zhì)量的前提下，合成時(shí)間越短越好，可以有效節(jié)約成本。

單一的合成時(shí)間（或每個(gè)堿基的合成時(shí)間）數(shù)據(jù)并不具有參考性，具備合成序列長(zhǎng)度及終產(chǎn)物的質(zhì)量背景是必要的，這樣合成時(shí)間的數(shù)據(jù)才有意義，才具有數(shù)據(jù)對(duì)比的可信性。

（3）合成規(guī)模范圍廣

（4）儀器功能選擇多樣且全面，靈活

（5）軟件使用滿足定制化需求，操作便捷，設(shè)計(jì)人性化

3. 含水量

寡核苷酸化學(xué)合成對(duì)水分極其敏感，環(huán)境的濕度，合成試劑/乙腈的含水量，配制單體質(zhì)量的完美度，都將對(duì)合成終產(chǎn)量產(chǎn)生影響。

4. 化學(xué)修飾

通常合成化學(xué)修飾的產(chǎn)物具有較差的偶聯(lián)效率，使偶聯(lián)效率低至90%的情況也并不罕見(jiàn)。修飾若是通過(guò)與胺，硫醇或羧基官能團(tuán)偶聯(lián)而制備，會(huì)受到諸多因素的影響，包括試劑的質(zhì)量和新鮮度，寡核苷酸的序列和緩沖液的質(zhì)量等等，即便是普通的共軛也可以對(duì)最終產(chǎn)品的產(chǎn)量產(chǎn)生相當(dāng)大的不利影響。

不同堿基的修飾其偶聯(lián)效率無(wú)法達(dá)到100%。例如：4個(gè)常見(jiàn) DNA 堿基的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)效率可達(dá)98-99.5%，而有些修飾堿基的偶聯(lián)效率可能低至50%。

5. 專業(yè)的技術(shù)人員及成熟的合成工藝

經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員及成熟的合成工藝對(duì)高效寡核苷酸的合成來(lái)說(shuō)必不可少。

6. 合成后的脫保護(hù)

對(duì)于沒(méi)有復(fù)雜化學(xué)修飾的寡核苷酸，只要脫保護(hù)試劑是新鮮的，不會(huì)有太大影響。特定的修飾需要非常溫和的脫保護(hù)條件，但是堿基可能無(wú)法完全去除保護(hù)基團(tuán)。在大多數(shù)情況下，堿基本身也會(huì)因脫保護(hù)反應(yīng)會(huì)有一些損傷，尤其對(duì)熒光染料標(biāo)記的產(chǎn)物會(huì)有不利影響，導(dǎo)致較低的產(chǎn)率。

7. 純化

純化是可能會(huì)損失大部分產(chǎn)量的步驟，即便高質(zhì)量的合成只是將適量的雜質(zhì)去除，也會(huì)損失一大部分產(chǎn)物。中等和較差質(zhì)量的合成會(huì)有更多的雜質(zhì)，為純化帶來(lái)更大的難度從而對(duì)產(chǎn)量有更加不利的影響。因此，無(wú)論合成質(zhì)量如何，純化過(guò)程的整個(gè)過(guò)程都會(huì)導(dǎo)致較低的總得率。在多種因素的影響下，理論產(chǎn)量的50%左右可被消耗。

此外，寡核苷酸上的修飾會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物與較短的片段共洗脫，因此純度對(duì)產(chǎn)量會(huì)有相當(dāng)大的影響，90%和95%的純度差異導(dǎo)致可能相差幾倍的終產(chǎn)量。

三、提升合成終產(chǎn)量的方法

雖然合成產(chǎn)物的損耗是必然的，但是盡可能地增加產(chǎn)量及減少產(chǎn)物的不必要損耗一直是技術(shù)創(chuàng)新與優(yōu)化的動(dòng)力和追求。對(duì)合成終產(chǎn)量的提升，可以從以下幾方面著手：

1. 使用高質(zhì)量合成試劑：采購(gòu)并使用具有質(zhì)量認(rèn)證的試劑、耗材等，合成實(shí)驗(yàn)所用的所有試劑需確保其新鮮度。

2. 優(yōu)化合成工藝：合成實(shí)驗(yàn)前儀器的準(zhǔn)確校準(zhǔn)是十分重要且必要的。在保證合成效率的前提下，合理優(yōu)化合成反應(yīng)時(shí)間。合成產(chǎn)量與合成效率非常非常的緊密相關(guān)，越高的合成效率往往需要越長(zhǎng)的合成時(shí)間。單純追求合成時(shí)間的縮短，必然會(huì)帶來(lái)合成效率的折損導(dǎo)致產(chǎn)量的大幅下降，反而會(huì)輕易增加更多更多成本的投入。

3. 使用性能參數(shù)優(yōu)佳的合成儀：在對(duì)比各品牌儀器的性能參數(shù)時(shí)，具備一定前提和背景的數(shù)據(jù)才是有意義且值得參考的。比如，在合成較長(zhǎng)鏈且可獲得一定的產(chǎn)物得率的情況下，合成效率可達(dá)99%以上；多長(zhǎng)的某種序列，合成質(zhì)量滿足于何種應(yīng)用場(chǎng)景，合成時(shí)間越短才越有優(yōu)勢(shì)。

來(lái)自 LGC Biosearch Technologies™ 的 —— MerMade™ 系列 DNA/RNA 合成儀

性能優(yōu)勢(shì)：

• 合成規(guī)模50 nmol、且序列長(zhǎng)度到80 nt，在同時(shí)滿足合成產(chǎn)量和合成長(zhǎng)度的前提下，效率可高達(dá)99%以上；

• 合成標(biāo)準(zhǔn)20 mer、用于PCR的寡核苷酸，可在3小時(shí)內(nèi)完成；

• 合成規(guī)模可達(dá)50-200 µmol;

• 靈活多樣的瓶位設(shè)計(jì)滿足豐富的修飾種類(lèi)；

• 儀器可做定制化升級(jí)；

• Trityl monitor；

• 軟件設(shè)計(jì)業(yè)內(nèi)口碑好，可滿足各種定制化需求，且操作便捷、設(shè)計(jì)人性化。

   

此外，LGC Biosearch Technologies 還提供廣泛的寡核苷酸合成試劑，包括修飾單體、CPG、合成柱等1000 多種專業(yè)產(chǎn)品，打造完善的整體核酸化學(xué) (NAC) 解決方案及全套產(chǎn)品組合，滿足用戶對(duì)相關(guān)寡核苷酸的需求。

LGC Biosearch Technologies 致力于提供一站式高品質(zhì)寡核苷酸產(chǎn)品，其質(zhì)量管理體系 (QMS) 獲得了 ISO 9001 認(rèn)證。所有關(guān)鍵原材料和所有中間體直至最終產(chǎn)品都在其QC流程的監(jiān)管范圍內(nèi)。在 QC 之后，所有批次都將經(jīng)過(guò) QA 審查。

如果客戶需要其他的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（例如 ISO 13485）認(rèn)證，LGC Biosearch Technologies 可提供其它流程來(lái)滿足特定需求。例如：除了質(zhì)量控制 (QC) 檢測(cè)和質(zhì)量保證 (QA) 審查外，也可以出具檢驗(yàn)報(bào)告書(shū) (CoA)，隨產(chǎn)品一起寄送到客戶手中以迎合大部分客戶的質(zhì)量需求。而且，還可提供與 QC 檢測(cè)結(jié)果一致的分析報(bào)告副本，和CoA隨附產(chǎn)品寄送給客戶，目前已為很多客戶提供過(guò)這類(lèi)服務(wù)。

對(duì)于有特定需求的客戶，LGC Biosearch Technologies 還可根據(jù) LCMS、NMR 和 HPLC 數(shù)據(jù)做雜質(zhì)分析。如有必要，還可在發(fā)貨前提供分析數(shù)據(jù)，和分析報(bào)告供客戶做預(yù)先核準(zhǔn)。

相信 LGC Biosearch Technologies 的一站式寡核苷酸合成產(chǎn)品會(huì)為您帶來(lái)良好的用戶體驗(yàn)！

Reference:

[01] Brown T, Brown T, Jr. (2005-2015) Solid-phase oligonucleotide synthesis. [Online] Southampton, UK, ATDBio. (Accessed October 6, 2015.)

[02] Hogrefe R. (2015) A Short History of Oligonucleotide Synthesis. [Online] San Diego, TriLink BioTechnologies. (Accessed October 8, 2015.)

* 本文轉(zhuǎn)載自LGC基因組學(xué)公眾號(hào)